Cara Uji Kandungan Virus

Uji Kandungan Virus atau disebut juga dengan Virus Content Test (VCT) adalah prosedur untuk mengetahui jumlah virus yang terkandung dalam suatu larutan/media dengan cara virus diencerkan (penipisan) bertingkat dengan kelipatan 10x sampai penipisan tertentu kemudian ditumbuhkan pada media kultur sesuai jenis virusnya.

Adapun jenis media tumbuh virus yang dipergunakan dalam pengujian titer virus adalah  telur berembrio, kultur jaringan atau hewan coba (ayam, mencit), sedangkan bahan pengencernya bisa berupa larutan Posphate Buffer Saline (PBS), NaCl Fisiologis atau Aqudest/Water for Injection.

Istilah dalam uji kandungan virus

1. Pengenceran 10x : 1 bagian virus diencrkan dengan 9 bagian larutan pengencer (biasanya larutan Posphate Buffer Saline, NaCl Fisiologis atau Aqudest/Water for Injection
2. EID50  (Egg Infective Dose50) :  dosis minimal yang masih dapat menginfeksi 50% telur berembrio yang ditandai dengan adanya perubahan pathologi anatomi dari embrio atau adanya agglutinasi pada cairan allantois (uji kandungan virus dengan menggunakan telur berembrio). Uji kandungan virus dengan menggunakan telur berembrio antara lain virus Newcastle Disease, Avian Influenza, Infectious Bronchitis, Infectious Bursal Disease, Egg Dtop Syndrome, Infectious laringitis dll.
3. TCID50 (Tissue Culture Infective Dose 50) : dosis minimal yang masih dapat menginfeksi 50% dari cell yang ditandai dengan munculnya cytophatic effect (CPE) pada sel-­selnya (uji kandungan virus dengan menggunakan kultur jaringan). Uji kandungan virus dengan menggunakan kultur cell antara lain virus Infectious laringitis, Adeno Virus, Reo Virus, Infectious Bursal Disease, virus Rabies, dll. 
4. MLD50% (Mice Lethal Dose 50) : dosis minimal yang masih dapat menginfeksi 50% dari mencit yang ditandai dengan adanya kematian mencit karena terinfeksi virus (uji kandungan virus dengan menggunakan mencit) Uji kandungan virus dengan menggunakan mencit  antara lain virus  Rabies. 
5. CLD50 (Chicken Lethal Dose 50) : dosis minimal yang masih dapat menginfeksi 50% dari ayam yang  ditandai dengan adanya kematian ayam karena terinfeksi virus (uji kandungan virus dengan menggunakan ayam), Uji kandungan virus dengan menggunakan ayam biasanya virus untuk uji tantang seperti Newcastle Disease, Avian Influenza dan Infectious  Bursal Disease, 

Alat dan bahan

1. Telur Berembrio : Ruang steril, Inkubator telur, vortex, tabung reaksi rak, rak tabung, dispenser pipet, pipet 10 ml dan 1 ml, syringe 1ml, telur, pembolong telur, sealent, telur berembrio, pelarut (pengencer)
2. Cell Culture : Ruang steril, Inkubator cell, microkop cell, vortex, tabung reaksi, rak tabung, dispenser pipet, pipet 10 ml dan 1 ml, cell monolayer 80% dalam microplate, pelarut (pengencer)
3. Mencit : Ruang steril, kandang mencit, vortex, tabung reaksi rak, rak tabung, dispenser pipet, pipet 10 ml dan 1 ml, syringe 1 ml, telur, mencit, pelarut (pengencer)
4. Ayam : Ruang steril, kandang ayam, vortex, tabung reaksi rak, rak tabung, dispenser pipet, pipet 10 ml dan 1 ml, syringe 1ml, ayam, pelarut (pengencer)

Prosedur

1. Pengenceran/Penipisan

• Disinfeksi area kerja BSC dengan kapas beralkohol 70%
• Tempatkan beberapa tabung reaksi sesuai dengan kisaran titer tertinggi virus di rak tabung dan beri nomor (jumlah pengenceran tergantung jenis virus)
• Pipet 4,5 ml PBS  dan masukan pada masing-masing tabung
• Pipet 0,5 ml sample virus dan masukan   kedalam tabung pengenceran tabung no 1) kocok sampai homogen dengan menggunakan vortex.
• Dari penipisan tabung pertama, pipet 0,5 ml dan masukan      kedalam pengenceran berikutnya (tabung no 2) kocok sampai homogen. Lakukan step ini sampai pada pengenceran terendah

2.Inokulasi pada telur berembrio

• Telur beri label identitas pengujian seperti  nama virus dan pengenceran 
• Dengan menggunakan pembolong telur (puncher), lubangi telur di tanda silang (+ 3 mm diatas rongga udara)
• Inokulasikan masing-masing penipisan virus dari empat pengenceran terendah sesuai dengan kisaran titer virus pada telur embrio tertunas   umur  9 - 11 hari sebanyak  0.1 ml / butir telur rute intra allantois, inta yolk sac atau chorioallantois (tergantung jenis virus), 5 butir setiap penipisan.
• Inokulasikan larutan PBS pada 5 butir telur embrio tertunas umur  9 - 11 hari masing-masing 0,1 ml (sebagai kontrol)
• Tutup lubang bekas inokulasi dengan sealent
• Inkubasikan pada suhu 37^oC selama 5-7 hari dan observasi setiap hari dengan cara diteropong dengan lampu pijar (candler),  embrio  yang mati  24  jam  post       inokulasi  dianggap  kematian  yang  tidak  spesifik  ( dibuang ).  Embrio  yang mati  sesudah  48  jam  dichilling pada suhu 4^oC - 8^oC,
• Pada akhir masa  inkubasi  telur yang tersisa dichilling di 4 ^oC - 8 ^oC selama minimal 2 jam.

3. Inokulasi Pada Cell culture

• Siapakan microplate dengan cell monolayer 80% 
• Buang media, kemudian cuci dengan PBS sebanyak 2 -3 kali baik perlakuan maupun kontrol
• Inokulasikan  ke empat pengenceran terendah sesuai dengan kisaran titer virus pada cell sebanyak 0,1 ml/well, 5 wll setiap penipisan
• Inkubasi di suhu 37 derajat dengan 5% CO2 selama 1 jam, untuk kontrol tidak dilakukan inkubasi, langsung ditambahkan media
• Setelah 1 jam diinkubasi buang suspensi virus yang tersisa, kemudian tambahkan media dengan 0,5% bovine serum sebanyak 0,1 ml/well, 
• Beri label identitas pengujian seperti  nama virus dan pengenceran
• Inkubasi di suhu 33 derajat
• Amati/observasi setiap hari dengan menggunakan mikroskop cell untuk mengetahui adanya infeksi virus yang ditandai dengan munculnya cytophatic effect (CPE)  yang timbul pada setiap penipisan.
• Pengamatan dilakukan selama 7 - 14 hari (tergantung jenis virus)

4. Inokulasi Pada Mencit (Uji Kandungan virus Rabies)

• Sipakan 40 mencit umur 3 - 4 minggu
• Kelompokan menjadi 4 kelompok sesuai penipisan/pengenceran
• Suntikan ke empat penipisan terendah sesuai dengan kisaran titer virus pada mencit sebanyak 0,03 ml dengan rute intracerebral, 10 mencit setiap penipisan
• Beri label identitas pengujian seperti  nama virus dan pengenceran
• Observasi setiap hari terhadap adannya gejala klinis dan kematian apada mencit
• Pengamatan dilakukan selama 7 - 14 hari (tergantung jenis virus)

5. Inokulasi Pada Ayam

Uji kandungan virus dengan menggunakan ayam biasanya untuk virus yang akan dipergunakan sebagai seed tantang pada uji potensi vaksin sesuai standar Farmakopi Obat Hewan Indonesia (FOHI 2013)

• Sipakan 40 ekor ayam  umur 3 - 4 minggu
• Kelompokan menjadi 4 kelompok sesuai penipisan/pengenceran
• Inokulasikan masing-masing penipisan virus dari empat pengenceran terendah sesuai dengan kisaran titer virus pada ayan  umur  3 - 4 minggu sebanyak  0.1 ml atau 1 ml/ akor ayam,  rute sesuai jeins virus, 10 ekor ayam setiap penipisan.
• Beri label identitas pengujian seperti  nama virus, pengenceran dan nomor ayam
• Observasi setiap hari terhadap adannya gejala klinis dan kematian pada ayam
• Pengamatan dilakukan selama 7 - 14 hari (tergantung jenis virus)

6. Penilaian Uji kandungan Virus (Judgement)

Biasanya untuk penilaian uji kandungan virus media tumbuh virus (host) yang terinfeksi disebut positif sedangakan untuk yang tidak terinfeksi disebut negatif/normal

Berikut tabel acuan penilaian uji kandungan virus

Cara menghitung Uji Kandungan Virus
Untuk menghitung titer virus pada uji ini bisa menggunakan metode Spearman Karber, rumusnya adalah  seperti ini :

EID50    = X + 1/2  - d∑ri   atau

                                 n

             = X + 0,5  - d∑ri
                                 n
Keterangan   :           
-   X     =  Pengenceran tertinggi (konsentrasi terendah)
-   ∑ri   =  Total yang tidak terinfeksi (negatif/normal)
-   n     =   Jumlah  telur/cell/mencit/ayam  yang  dipakai  pada  setip penipisan
-   d     =   log  dari  factor  penipisan (log 10 =1).

Contoh kita punya data seperti dibawah ini :

Maka perhitungan adalah :

EID50 = 8 + 0,5 - 1 x 5
                                5
            = 8,5 - 1
            = 7,5
Jadi kandungan virus AI adalah 10^7,5/0,1 ml (jika inokulasingya 0,1 ml/butir)
Untuk mengetahui kandungan virus keseluruhan ( misal 1 liter) maka tinggal mengalikan saja
1000 ml (1 liter) = 10³)

Maka :  

            = 10^7,5 x 10³

               =10^{10,5/1 liter}


Semoga bermanfaat....

Amiin..............