Cara Uji Kandungan Virus ND (Newcastle Disesease) Menggunakan Telur Berembrio

Cara Uji Kanungan Virus ND (Newcastle Desease) 

dalam suatu sediaan (cair maupun padat) adalah dengan cara virus tersebut diencerkan dalam larutan buffer sampai peneipisan tertentu, kemudian masing-masing pengenceran/penipisan virus ditanam/ditumbuhkan pada telur berembrio, selanjutnya telur tersebut diinkubasi di suhu 37⁰C selama 5 hari. Larutan yang biasa dipakai untuk pengenceran virus menggunakan larutan Phosphat Buffer Saline (PBS), NaCl fisiologis, cara membuat larutan PBS silahkan baca artikel Prosedur Pembuatan Phosphat Buffer Salne 

Alat dan Bahan

Untuk menghindari kontaminasi dari mikro organisma lain alat dan bahan-bahan yang berhubungan langsung dengan virus harus terlebih dahulu di sterilisasi. Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

• Biosafety Cabinet
• Tabung reaksi 
• Pipet steril Vol. 10 ml & 1 ml
• Spuit 1 ml
• Alat Pengocok (Vortex)
• Sprayer alcohol 70%
• Pembolong Telur (Puncher)
• Gunting
• Kaca plat/petri disk
• Batang pengaduk (stick gelas)
• Single pipette 50 μl
• Pipet tip
• Candler
• Sampel virus ND (Fluida/bulk/Freez drying)
• 25 butir telur ayam SPF/Clean egg masa inkubasi 9 -11 hari
• Phosphat Buffer Saline (PBS)
• Silicon rubber/paraffin
• Kapas beralkohol 70%
• RBC 10% (baca artkel : Cara Pembuatan RBC)
• Tissue

Persiapan

Teropong (Candling) telur untuk mengetahui posisi embrio dan rongga udara, dengan menggunakan pensil beri tanda +3 mm di atas rongga udara, beri nama setiap telur sesuai dengan nama sampel dan tingkat penipisannya

Oles dengan kapas beralkohol disekitar tanda pada area rongga udara.

Prosedur

1. Virus dalam Sedian Cair

• Disinfeksi area kerja BSC dengan kapas beralkohol 70%
• Tempatkan beberapa tabung reaksi di rak tabung dan beri nomor, jumlah tabung sesuai dengan kisaran titer virus ND
• Pipet 4,5 ml PBS dan masukan pada masing-masing tabung
• Pipet 0,5 ml sample virus ND dan masukan kedalam tabung no 1 (10⁻¹) kocok sampai homogen dengan menggunakan vortex.
• Dari penipisan tabung pertama, pipet 0,5 ml dan masukan kedalam penipisan berikutnya (tabung no 2) kocok sampai homogen. Lakukan step ini sampai pada penipisan terendah
• Dengan menggunakan pembolong telur (puncher), lubangi telur (+ 3 mm diatas rongga udara)
• Inokulasikan empat penipisan virus mulai dari penipisan terendah  (sesuai dengan kisaran titer ND) pada telur embrio tertunas umur 10 hari sebanyak 0.1 ml / butir telur, rute intra allantois, 5 butir setiap penipisan.
• Inokulasikan larutan PBS pada 5 butir telur embrio tertunas umur 10 hari masing-masing 0,1 ml (sebagai kontrol)
• Tutup lubang bekas inokulasi dengan sealent/paraffin
• Inkubasikan pada suhu 37⁰C selama 5 hari dan observasi setiap hari dengan cara diteropong dengan lampu pijar (candler), embrio yang mati 24 jam post inokulasi dianggap kematian yang tidak spesifik (dibuang). Embrio yang mati sesudah 48 jam dichilling pada suhu 4⁰C
• Pada akhir masa inkubasi telur yang tersisa dichilling di 4⁰C selama minimal overnight

2. Virus dalam Sedian Freeze Drying

Untuk virus dalam bentuk Freeze Drying, sebelum dilakukan pengenceran (10⁻¹ dan seterusnya) virus dilarutkan terlebih dahulu dengan PBS sampai kandungannya 1 dosis (per 0,1 ml),  

Cara mengencerkan virus menjadi 1 dosis

Dosis per vial	Pengenceran 10 ds/0.1 ml	Pengenceran 1 ds/0.1 ml
500	1 vial + 5 ml PBS	1 ml vaksin + 9 ml PBS
1000	1 vial + 10 ml PBS	1 ml vaksin + 9 ml PBS
2000	1 vial + 20 ml PBS	1 ml vaksin + 9 ml PBS

Selanjutnya dilakukan pengenceran mulai 10⁻¹ sampai penipisan terendah sesuai perkiraan titer virus yang terkandung (pengerjaannya seperti pada step pengenceran virus dalam bentuk cair)

Penilaian (Judgement)

• Dengan menggunakan gunting buka kerabang telur
• Pipet maing-masing 50 μl RBC 10%, letakan pada kaca plat (sesuai jumlah telur)
• Pipet 50 ml cairan allantois dari masing-masing telur pada setiap penipisan, dan campurkan kedalam RBC 10%, homogenkan menggunakan stick, lap stick menggunakan tissue.
• Homogenkan campusan virus dan RBC dengan cara menggoyang-goyangkan kaca plate selama 15 detik sambil diamati terbentuknya agglutinasi.
• Agglutinasi dianggap positif jika terbentuk butiran-butiran warna merah (agglutinasi)
• Hitung titer virus menggunakan metode “Spearman – Karber”
• Perhitungan metode “Spearman – Karber” berdasarkan log 10 EID₅₀.

Foto hasil uji rapid virus ND

Rumus :

EID50    = X + 1/2  - d∑ri   atau

                                 n

             = X + 0,5  - d∑ri
                                 n
Keterangan   :           
-   X     =  Pengenceran tertinggi (konsentrasi terendah)
-   ∑ri   =  Total yang tidak terinfeksi (negatif/normal)
-   n     =   Jumlah  telur/cell/mencit/ayam  yang  dipakai  pada  setip penipisan
-   d     =   log  dari  factor  penipisan (log 10 =1)

Contoh Hasil Penilaian VCT

Hasil Uji Rapid Agglutinasi VCT Virus ND

Pengenceran	Positif (agglutinasi)	Negatif
10-6	5	0
10-7	5	0
10-8	4	1
10-9	0	5
Kontrol	0	5

Perhitungannya :
EID₅₀  = 9 + 0,5 - 6/5
          = 9,5 - 1,2
          = 8,3
maka titer virus ND (Newcastle Disesease) hasil dari uji kandungan virus adalah : 10⁸.³EID₅₀

Definisi

• Fluida (Bulk) adalah cairan alantois hasil panen  dari telur yang telah ditanam virus ND
• Telur SPF (Specific pathogen Free) adalah telur ayam yang tidak mempunyai antibodi berasal dari turunan ayam petelur yang tidak/belum pernah divaksinasi dan bebas dari penyakit mematikan.
• Clean Egg adalah telur ayam yang yang tidak mempunya antibodi tertentu

Pustaka

Farmakope Obat Hewan Indonesia Jilid I (sediaan Biologik) edisi 3 tahun 2013. Direktorat Jenderal Pertenakan Departemen Pertanian Republik Indonesia

Semoga Bermanfaat........