Cara Uji Kandungan Virus EDS (Egg Drop Sindrome) Menggunakan Telur Berembrio

Foto koleksi Poultry Indonesia

Untuk mengetahui kandungan virus EDS (Egg Drop Syndrome) dapat dilakukan dengan cara virus tersebut diencerkan dalam larutan buffer sampai peneipisan tertentu, kemudian masing-masing pengenceran/penipisan virus  ditanam/ditumbuhkan pada telur bebek berembrio, selanjutnya telur tersebut diinkubasi di suhu 37⁰C selama 5 hari. Larutan yang biasa dipakai untuk pengenceran virus menggunakan larutan Phosphat Buffer Saline (PBS), NaCl fisiologis, cara membuat larutan PBS silahkan baca artikel Prosedur Pembuatan Phosphat Buffer Salne 

Alat dana Bahan

Untuk menghindari kontaminasi dari mikro organisma lain alat dan bahan-bahan yang berhubungan langsung dengan virus harus terlebih dahulu di sterilisasi. Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

• Biosafety Cabinet
• Tabung reaksi 18 x 180 mm
• Pipet steril Vol. 10 ml & 1 ml
• Spuit 1 ml
• Alat Pengocok (Vortex)
• Sprayer alkohol 70%
• Pembolong Telur (Puncher)
• Gunting
• Kaca plat
• Batang pengaduk (stick gelas)
• Single pipette 50 μl
• Pipet tip
• Candler
• Sampel virus EDS (bulk)
• 25 butir telur bebek masa inkubasi 10 -12 hari
• Phosphat Buffer Saline (PBS)
• Silicon rubber/paraffin
• Kapas beralkohol 70%
• RBC 10% (baca artkel : Cara Pembuatan RBC)
• Tissue

Persiapan

Teropong (Candling) telur untuk mengetahui posisi embrio dan rongga udara, dengan menggunakan pensil beri tanda  (+3 mm) diatas rongga udara, beri nama setiap telur sesuai dengan nama sampel dan tingkat penipisannya

Prosedur

• Disinfeksi area kerja BSC dengan kapas beralkohol 70%
• Tempatkan beberapa tabung reaksi di rak tabung dan beri nomor, jumlah tabung sesuai dengan kisaran titer virus EDS
• Pipet 4,5 ml PBS dan masukan pada masing-masing tabung
• Pipet 0,5 ml sample virus ND dan masukan kedalam tabung no 1 (10⁻¹) kocok sampai homogen dengan menggunakan vortex.
• Dari penipisan tabung pertama, pipet 0,5 ml dan masukan kedalam penipisan berikutnya (tabung no 2) kocok sampai homogen. Lakukan step ini sampai pada penipisan terendah
• Oles dengan kapas beralkohol disekitar  area rongga udara.
• Dengan menggunakan pembolong telur (puncher), lubangi telur di tanda silang (+ 3 mm diatas rongga udara)
• Inokulasikan penipisan fluida dari empat penipisan terendah sesuai dengan kisaran titer EDS pada telur bebek embrio tertunas umur 10 hari sebanyak 0.1 ml / butir telur, rute intra allantois, 5 butir setiap penipisan.
• Inokulasikan larutan PBS pada 5 butir telur bebek berembrio tertunas umur 10 hari masing-masing 0,1 ml (sebagai kontrol)
• Tutup lubang bekas inokulasi dengan sealent/paraffin
• Inkubasikan pada suhu 37⁰C selama 5 hari dan observasi setiap hari dengan cara diteropong dengan lampu pijar (candler), embrio yang mati 24 jam post inokulasi dianggap kematian yang tidak spesifik ( dibuang ). Embrio yang mati sesudah 48 jam dichilling pada suhu 4⁰C
• Pada akhir masa inkubasi telur yang tersisa dichilling di 4⁰C, minimal overnight

Penilaian (Judgement)

• Dengan menggunakan gunting buka kerabang telur
• Pipet maing-masing 50 μl RBC 10%, letakan pada kaca plat (sesuai jumlah telur)
• Pipet 50 ml cairan allantois dari masing-masing telur pada setiap penipisan, dan campurkan kedalam RBC 10%, homogenkan menggunakan stick, lap stick menggunakan tissue.
• Goyang-goyangkan kaca selama 15 detik sambil diamati terbentuknya agglutinasi.
• Agglutinasi dianggap positif jika terbentuk butiran-butiran warna merah (agglutinasi)
• Hitung titer virus menggunakan metode “Spearman – Karber”
• Perhitungan metode “Spearman – Karber” berdasarkan log 10 EID₅₀.

Perbedaan Embrio yang terinfeksi virus IB dan kontrol

Rumus :

EID50    = X + 1/2  - d∑ri   atau

                                 n

             = X + 0,5  - d∑ri
                                 n
Keterangan   :           
-   X     =  Pengenceran tertinggi (konsentrasi terendah)
-   ∑ri   =  Total yang tidak terinfeksi (negatif/normal)
-   n     =   Jumlah  telur/cell/mencit/ayam  yang  dipakai  pada  setip penipisan
-   d     =   log  dari  factor  penipisan (log 10 =1)

Contoh Hasil Penilaian VCT

Hasil Uji Rapid Agglutinasi VCT Virus EDS (Egg Drop Syndrome)

Pengenceran	Positif (agglutinasi)	Negatif
10-6	5	0
10-7	5	0
10-8	4	1
10-9	1	4
Kontrol	0	5

Perhitungannya :

EID₅₀  = 9 + 0,5 - 5/5

          = 9,5 - 1

          = 8,5

maka titer virus EDS (Egg Drop Syndrome) hasil dari uji kandungan virus adalah : 10⁸․⁵EID₅₀

Definisi

• Fluida (Bulk) adalah cairan alantois hasil panen  dari telur yang telah ditanam virus EDS
• Telur SPF (Specific pathogen Free) adalah telur ayam yang tidak mempunyai antibodi berasal dari turunan ayam petelur yang tidak/belum pernah divaksinasi dan bebas dari penyakit mematikan.
• Clean Egg adalah telur ayam yang yang tidak mempunya antibodi tertentu

Pustaka

Farmakope Obat Hewan Indonesia Jilid I (sediaan Biologik) edisi 3 tahun 2013. Direktorat Jenderal Pertenakan Departemen Pertanian Republik Indonesia

Semoga Bermanfaat........