Cara Isolasi Virus Avian Influenza H5N1

Ada beberapa cara untuk mendapatkan virus Avian Influenza (AI) diantaranya adalah dengan cara swab cairan pada organ trachea atau dengan mengeluarkan virus tersebut dari sel organ (unggas) yang terinfeksi, proses tersebut dinamakan isolasi. Organ-organ yang terinfeksi virus akan terjadi perubahan dari biasanya (pathologi anatomi), perubahan tersebut  ditandai dengan perubahan ukuran (besar/kecil), kebengkakan, warna dll. Gejala klinis yang yang muncul pada ayam biasanya tingkat kematian yang tinggi,vial dan jengger berwarna kebiruan, diare dan adanya leleran cairan pada hidung. Adapun perubahan anatominya (PA) yang disebabkan virus AI diantaranya adalah kemerahan pada lemak jantung dan trachea, terjadi dilatasi pembuluh darah otak, bahkan apabila virus yang menyerang ungas tersebut sangat ganas akan terjadi haemorhagi dihampir seluruh organ. Unggas yang bisa terserang virus Avian Influenza diantaranya : Ayam, itik, kalku, burung puyuh dan brung unta. Adapun proses isolasi virus AI adalah sebagai berikut :

Alat/mesin

• Bsc (Biosafety Cabinet)
Sebaiknya dalam proses isolasi virus AI dilakukan dalam BSC supaya virus tidak menyebar kemana-mana dan hasil isolasi tidak terkontaminasi microorganisma lain terutama bakteri dan jamur

• Mortar
Sebagai alat penghancur/mengaluskan organ (secara konvensinal)

• Blender
Fungsinya sama dengan mortar hanya saja proses akan lebih aseptis

• Homogenizer
Fungsinya sama dengan mortar atau blender, selain aseptis organ akan lebih halus karena putarannya lebih tinggi dan lebi cepat dari blender

• Sentrifus
Untuk mensentrifus organ yang sudah dihaluskan sehingga terpisahnya cairan virus (suspensi dan cell organ (sedimen), sebaiknya sentrifus yang digunakan adalah sentrifus refrigerator sehingga dapat di seting dengan suhu 2-8°C

• Cryo tube atau vial
Mendistribusikan/aliquot suspensi virus

Bahan

• Specimen/sampel organ (isolat)

Sampel organ yang diproses sebaiknya organ-organ yang mempunyai PA yang jelas dengan asumsi bahwa organ tersebut terinfeksi virus AI, dalam transfortasinya specimen (organ) sebaiknya menggunakan larutan PBS sehingga virus yang ada didalam sel tetap hidup

• Buffer salin (PBS) 

Dalam pembuatan PBS dengan pH7,2 – 7,4 adalah larutan penyangga yang baik untuk digunakan dalam proses isolasi virus karena PBS dapat mempertahankan konstan pH dan osmolaritas sel. (Lihat Prosedur Pembuatan PBS......)

Proses Isolasi

Dalam melakukan proses isolasi sebaiknya dilakukan diruang bersih (laboratorium) dengan sistim tata udara yang terkontrol, alat-alat yang dipergunakan seperti gunting, pinset dilakukan sterilisasi terlebih dahulu dan  dilengkapi dengan APD (alat perlindungan diri) seperti masker dan sarung tangan.

Untuk membersihkan specimen dari kotoran yang tidak dikehendaki terlebih larutan (transport media) dibuang, kemudian organ dicuci den PBS yang mengandung antibiotic (penicillin, setretomicyn dan kanamisin), sebaiknya pencucian tidak berulang-ulang untuk menghindari virus yang terbuang cukup 1 atau 2 kali pencucian.

Selanjutnya organ di haluskan dengan cara digerus atau diblender, kemudian tambahkan larutan PBS dengan konsentrasi akhir (suspensi) 10% sampai dengan 50%, supaya suspensi benar-benar tercampur dengan baik (homogen) lakukan pengocokan atau pemblenderan kembali.

Untuk memisahkan antara  PBS (larutan  virus)  dengan sedimen (sel organ) lakukan sentrifugasi dengan 6000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4°C, ambil supernatanya dan distribusikan (aliquot) kedalam cryogenic tube masing-masing 1 ml  kemudian diberi label antara lain nama isolat, tanggal proses isolasi. Supaya isolat tersebut tetap hidup dalam jangka waktu yang lama sebaiknya disimpan di deep freezer dengan suhu -86°C

Proses selanjutnya adalah pasase isolat pada telur berembrio (sebaiknya telur SPF), identifikasi dll. Proses tersebut bisa dilakukan kapan saja disesuaikan dengan kebutuhan

Skema Proses isolasi

Pasase Isolat

Untuk perbanyakan  virus yang nantinya akan dipergunakan sebagai stok virus untuk keperluan proses selanjutnya seperti working seed (WS), identifikasi, pembauatan antigen dll, virus hasil isolasi (isolat) ditumbuhkan pada telur berembrio.

• Inokulasi

Virus ditanam pada telur SPF (Spesific pathogen Free) berembrio dengan masa inkubasi 9 sampai 12 hari sebanyak 0,1 sampai dengan 0,3 ml/butir. Penentuan umur inkubasi telur itu tergantung hasil dari optimasi, karena masing-masing virus mempunyai karakteristik yang berbeda

•  Inkubasi

Telur yang sudah ditanam virus diinkubasi di inkubator telur dengan suhu 37°C dengan kelembaban 50 sampai 60%

• Observasi (candling)

Lakukan observasi telur (candling) untuk melihat kematian embrio, kematian embrio akibat virus AI biasanya anatara 17 jam sampai 30 jam post inoklasi. Disini perlunya memperhitungkan waktu inokulasi supaya telur yang mati untuk segera di chilling (disimpan pada suhu 4°C) karena telur yang mati terlalu lama di inkubator akan merusak virus dan mungkin juga kematian virus.

• Uji Agglutinasi

Sebelum dilakukan pengambilan cairan allantois yang mengandung virus

AI terlebih dahulu masing-masing telur dlakukan uji agglutinasi (rapid test) dengan cara mencampur 1 bagian cairan allantois dengan 1 bagian red bloodcell (RBC) 10%,
Cairan allantois yang mengandung virus AI akan terjadi agglutinasi (butiran darah) pada saat dicampur dengan RBC.

• Panen (harvest)

Sebelum cairan alantoisnya dipanen, telur terlebih dahulu disimpan di cool room suhu 4 derajat celcius (chilling) untuk meminimalisir terbawanya darah pada saat cairan allantois dipanen.
Ambil semua cairan allantois dengan menggunakan syringe 5 ml atau 10 ml dan tampung dalam tabung sentrifus, cairan allantois yang dipanen hanya telur yang menunjukan adanya agglutinasi

• Sentrifugasi

Untuk membersihkan cairan allantois hasill panen dari kotoran (debris sel/partikel lainnya) lakukan setrifugasi selama 10 menit dengan 6000 rpm dan suhu 4°C. ambil supernatanya

• Distribusi (aliquot) dan penyimpanan
Supernatan (allantois berisi virus) hasil sentrifus di aliquot kedalam cryogenic tube (vial) sebanya @ 1 ml dan disimpan di suhu -86°C (deep freezer) sebagai stok virus

Pengujian

Pengujian virus yan harus dilakukan adalah :

• Uji Kandungan Virus
• Virus Hemaglutination (HA-test)
• Uji Sterilitas

Semoga Bermanfaat bermanfaat.........

Amiin..........