Cara Isolasi Virus Infectious Bronchitis (IB)

Infectious Bronchitis (IB) adalah penyakit yang menyerang semua umur ayam. Pada anak ayam, akibat serangan virus ini ditandai dengan  bersin-bersin, ngorok, sesak napas/megap-megap. Sedangkan pada ayam dewasa terutama ayam petelur selain gangguan pernapasan juga menyebabkan menurunnya produksi telur serta lunaknya kerabang telur dan bentuknya tidak teratur (abnormal).
Untuk mendapatkan virus IB dari ayam yang  terkena penyakit  adalah dengan cara mengisolasinya dari organ-organ yang terinfeksi seperti trachea, paru-paru, ginjal, ovarium atau bisa juga dengan swab cairan yang terdapat di trachea. Dari pengalaman yang saya alami dalam hal mengisolasi virus, isolasi virus IB  ini sedikit lebih rumit dan harus sabar dibandingkan dengan isolasi virus lainnya seperti virus Avian Influenza (AI) atau virus Newcastle Disease (ND). Sebaiknya isolasi virus dilakukan pada beberapa kelompok ayam mulai dari kelompok yang baru terinfeksi, sedang dan ayam yang sudah sakit parah, biasanya virus diperolah pada ayam dengan gejala klinis ringan.

1. Pengambilan Sampel
Untuk menghindari kontaminasi bakteri sebaiknya organ-organ yang terinfeksi diambil secara aseptik mungkin dan dimasukan kedalam larutan buffer posphat saline (media transport) yang mengadung antibiotik PSK (Penicilin, streptomycin dan Kanamycin) dan organ dibawa kelaboratorium dalam keadaan dingin dengan suhu antara 2-8 derajat celcius. Untuk membuat larutan buffer silahkan baca artikel saya tentang Prosedur Pembuatan Posphat Buffer Saline (PBS). Pengambilan sampel untuk isolasi virus IB diantaranya adalah :

• Organ yang terinfeksi
Organ yang diambil untuk isolasi virus IB adalah organ saluran pernapasan (Trachea, bronkus, Paru-paru), saluran reproduksi dan ginjal.

• Swab Trachea
Swab dilakukan untuk mengambil cairan yang terdapat di daerah trachea dengan menggunakan cotton swab steril yang dimasukan kedalam trachea ayam sakit, selanjutnya hasil swab masukan ke dalam larutan buffer posphat saline yang mengandung antibiotik.

2. Isolasi

Proses isolasi virus Infectious Bronchitis sebaiknya dilakukan di dalam Biosafety Cabinet dengan ruangan yang steril, Ruang steril dan Biosafety Cabinet diperlukan untuk menghindari kontaminasi baik  dari ruangan ke isolat maupun dari isolat ke ruangan (lingkungan)

• Sampel Organ

Media transport dibuang terlebih dahulu lalu organ dicuci dengan larutan PBS yang mengandung antiibotik sebanyak 2-3 kali. Jika sampel spesimen lebih dari 1 jenis organ dalam proses isolasinya bisa masing-masing organ atau dipool menjadi 1 sampel. Setelah pencucian, organ dihaluskan dengan cara di gerus, blender atau bisa juga dengan menggunakan mesin homogenizer. Setelah organ cukup halus, tambahkan larutan PBS menjadi suspensi dengan konsentrasi akhir 20 - 50%, kemudian kocok sampai homogen, selanjutnya disntrifus dengan 6000 rpm selama 10 menit, ambil supernatannya dan aliquot kedalam cryogenic tube @ 1 ml, jangan lupa diberi label identitas isolat (nama isolat, tanggal isolasi dll). Isolat disimpan di deep freezer dengan suhu -80 s/d -86 derajat celcius untuk dilakukan proses selanjutnya seperti passase, identifukasi, uji sterility test dll.

• SwabTrachea

Buang cotton swabnya, kemudian larutan virus disentrifuse dengan 6000 rpm selama 10 menit, ambil supernatannya dan aliquot kedalam cryogenic tube @ 1 ml, jangan lupa diberi label identitas isolat (nama isolat, tanggal isolasi dll). Isolat disimpan di deep freezer dengan suhu -80 s/d -86 derajat celcius untuk dilakukan proses selanjutnya seperti passase, uji sterility test dll.

3. Pasase Isolat pada telur berembrio (TAB)Pasase atau menumbuhkan virus  sebenarnya bisa langsung dilakukan setelah proses isolasi jika sebelumnya sudah dipersiapkan telur SPF (specific Pathoen Free) atau SAN (Serum Antibodi Negatif). dengan masa inkubasi antara 9 sampai 11 hari

• Inokulasi/infeksi 

Siapkan 10 butir telur berembrio, candling (teropong dengan menggunakan lampu) untuk memastikan telur yang digunakan hidup, tandai tepat pada batas rongga udara telur, kemudian ulas dengan kapas berlakohol 70% pada area penyuntikan dan lubangi telur +3 mm diatas batas rongga udara. Suntikan virus sebanyak 0,2 sampai 0,3 ml per butir kemudian tutup lubang bekas penyuntikannya dengan sealent dan inkubasi di suhu 37 derajat celcius dengan kelembaban 50 - 65%

• Observasi

Lakukan obsevasi telur (candling) setiap 2-4 jam sekali setelah 24 jam post infeksi, simpan telur yang mati disuhu dingin (chlling), jika masih ada telur yang tetap hidup, lakukan observasi sampai pada jam ke 54-60 post infeksi. Setelah jam ke 60 telur yang masih hidup dichilling dan sisakan sebagian telur yang hidup untuk dilanjutkan inkubasinya sampai hari ke 7 post inokulasi.

• Harvest (panen)

Desinfeksi semua telur yang akan di harvest dengan alkohol 70%, buka kerabang telur, ambil cairan allantoisnya baik telur yang mati maupun yang chilling hidup dan tampung di botol steril. Setelah semua cairan allantois diharvest lakukan sentrifus dengan 6000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4 derajat celcius. Setelah selesai proses sentrifus ambil supernatannya dan aliquot cairan virus tersebut kedalam cryogenic tube @ 1 ml dan simpan di suhu -80 s/d -86 derajat celcius sebagai stok virus untuk keperluan proses selanjunya seperti pasase, identifikasi, uji kandingan virus, uji sterilitas dll.

• Judgemnt 

Buka semua telur baik yang mati, chilling hidup maupun telur yang dilanjutkan inkubasinya sampai hari ke 7 untuk melihat perubahan pathologi antomi (PA) dari embrio. Embrio yang terinfeksi virus Infectious Bronchitis akan mengalami perubahan seperti : Curling, Kerdil, Haemorhagi, Pucat, Hati berwarna hijau

Perubahan PA pada embrio bisa hanya salah satu dari ciri-ciri diatas, sementara embrio yang tidak terinfeksi tidak ada perubahan PA.

Catatan :

• Jika pada pasase ke 1 tidak terjadi kematian atau embrio tidak ada perubahan  PA yang menciri, lakukan pasase  ke-2 dan seterusnya.
• Apabila sampai pasase ke-3 tidak ada kematian dan PA embrio normal, pasase tidak perlu diteruskan, artinya isolat tersebut tidak terdapat virus IB
• Sebaiknya setiap kali pasase ada telur yang inkubasinya dilanjutkan sampai hari ke 7 post inokulasi karena telur yang terinfeksi virus IB, PA embrionya akan terlihat jelas

Semoga bermanfaat.
Amiin.............