Cara Meningkatkan Titer Virus dalam Cairan Allantois Telur Ayam Berembrio (TAB)

Telur ayam  berembrio (TAB) adalah salah satu media yang baik untuk berkembangnya (replikasi) virus-virus yang menyerang unggas diantaranya virus Avian Influenza (AI/Flu Burung), Infectious Bronchitis (IB), Infectiuos Bursal Disease (Gumboro),  dll, sehingga produksi virus dengan menggunakan telur ayam berembrio hingga kini masih tetap dipakai baik  skala penelitian maupun produksi vaksin  oleh produsen vaksin lokal maupun impor,  karena selain telur mudah didapat juga proses produksinya dianggap cukup mudah.

Sebaiknya telur yang dipergunakan dalam pengembangbiakan  virus menggunakan telur ayam SPF (Specific Pathogen Free)  atau SAN (spesifik antibodi negatif). Adapun yang dimaksud dengan telur SPF adalah  telur berasal dari ayam yang  tidak memiliki antibodi spesifik terhadap agen pathogen sehingga telur yang dihasilkan juga tidak memiliki antibodi yang spesifik sedangkan telur SAN adalah telur yang dihasilkan dari ayam yang tidak mempunyai antibodi tertentu (kualitas telur di bawah telur SPF).

Adapun mekanisme replikasi (reproduksi) virus adalah virus yang ditanam ke dalam telur melalui intra allantois/chorioallantois atau intra yolk sac diawali dengan adanya perlekatan (adsorbsi) partikel virus dengan reseptor pada permukaan sel inang kemudian virus akan masuk ke dalam sel yang disebut dengan istilah penetrasi, selanjutnya virus akan memindahkan  sebagian atau seluruhnya kapsidnya  kedalam sel  setelah itu terjadi perakitan komponen-koponen virion  dan   terjadi pematangan virus dan kemudian step terakhir adalah pelepasan virus yang sudah matang memalui cairan allantois.

Supaya perkembangan embrio pada saat diinkuabsi/pengeraman tumbuh dengan baik maka suhu inkubator antara 37°C - 39°C dengan kelembaban 50 – 65% (60% sering dianggap kelembaban yang ideal)

Passase

Prosedur ini biasanya delakukan pada virus hasil isolasi yang belum banyak dilintaskan  (ditanam) pada hostnya (TAB, Cell culture, hewan coba) dan biasanya virus belum stabil yang ditandai dengan  tidak konstannya titer virus walaupun dalam prosedur pasasenya sama, baik jumlah partikel yang ditanam maupun lama inkubasinya.  

Pada metode ini  virus dilintaskan pada TAB secara terus menerus sampai mendapatkan titer virus yang tinggi dan setabil, pasase bisa dilakukan dengan cara blank pasase (titer awal virus tidak diketahui)  atau yang sudah diketahui titernya kemudian ditetapkan jumlah partkel yang diinokulasikan ke dalam TAB

Jumlah Partikel Inokulum

Penentuan jumlah partikel inokulum setiap jenis virus mungkin akan berbeda karena masing-masing virus mempunyai karakteristik yang berlainan,  sehingga untuk menentukan jumlah partikel inokulum yang pas perlu dilakukan trial terlebih dahulu (optimasi jumlah partikel) sehingga diperoleh jumlah virus  yang maksimal pada saat panen cairan allantois.
Sebagai contoh kita akan mentukan jumlah partikel virus pada pembuatan working seed  virus Avian Influnza H5N1 yang nantinya akan dijadikan dasar (standar) pada saat produksi bulk virus untuk produksi vaksin AI.

Tahapanya adalah sebagai berikut :

• Virus yang akan dipergunakan harus terlebih dahulu diketahui titernya misal titer awal 10˄^6.0/0,1 ml  (titer virus diketahui dengan metode pengenceran bertingkat 10x)
• Tentukan jumlah partikel yang akan ditanam pada masing masing telur missal kita trial dengan 500 partikel, 1000 partikel dan 5000 patikel, masing-masing trial menggunakan 5 butir telur  ayam SPF
• Tanam dari masing-masing trial ke 5 butir @ 0,1 ml telur SPF umur 10 – 12 hari masa inkubasi
• Inkubasi di suhu 37°C
• Lakukan observasi (candling) telur setiap 2- 3 jam setelah jam ke 20 post inokulasi (lebih cepat lebih baik (rata-rata kematian telur yang terinfeksi virus AI diantara 20 – 32 jam post inokulasi (infeksi)
• Telur yang  mati  di simpan di suhu 2 - 8°C.
• Kemudian masing-masing telur dilakukan uji agglutinasi (cairan allantois yang diambil hanya telur yang menujukan positif agglutinasi), Uji agglutinasi bisa dilihat pada artikel saya sebelumnya : Cara isolasi Virus Avian Influenza klik disini……
•  Masing-masing  trial dilakukan uji kandungan virus untuk mengetahui trial yang menujukan titer paling tinggi.
•  Untuk validitas dari trial tersebut, lakukan  trial minimal 3 kali ulangan
• Cara menghitung jumlah partikel virus :
• Misal diketahui titer virus 10˄^6.0/ 0,1 ml (1.000.000 partikel/ml) volume virus 1 ml
• Rencana trial inokulasi : 10˄^2.7 (500 partikel), 10˄^3.0 (1000 partikel) dan 10˄^3.7 (5000 partikel)
• Berapa volume virus yang dibutuhkan?
• Berapa volume pengencer (PBS) yang dibutuhkan?
• Untuk menghitung trial inokulasi dengan 5000 partikel/butir adalah :

1. Dengan rumus M1.V1 = M2.V2
Menghitung yang 5000 partikel dengan kebutuhan 1 ml :
Maka :
1.000.000 x ? = 5000 x 1 ml
                     = 5.000
                        1.000.000
                     = 0.005
Jadi kebutuhan virusnya 0,005 ml + 0,995 ml pengencer (PBS)
2. Atau bisa dihitung dengan cara dibawah ini
10˄6.0 - 10˄3.7 = 10˄2.3Jadi encerkan virus sampai 10-2 (pengenceran 10 kali)
Kemudian dari 10-2 diencerkan lagi sebanyak 2 kali
Lebih jelasnya lihat skema dibawah ini :

Lama inkubasi (Jam Inkubasi)
Metode ini biasanya digunakan untuk virus yang mempunyai sifat tidak mematikan embrio telur, seperti virus Newcastle Disease, infectious bronchitis yang dipakai untuk produksi vaksin aktif, caranya adalah sebagi berikut :

• Tanam virus (missal 1000 partkel/telur ) sebanyak 20 butir  telur ayam berembrio umur 9 – 11 hari
• Inkubasi di suhu 37°C
• Lakukan observasi (candling) telur
• Chilling telur per 6 jam mulai  jam ke 48, 54, 60 dan 66 masing-masing 5 butir (penetuan jam chilling disesuaikan dengan karakter virus)
• Panen cairan allantoisnya dari masing-masing kelompok
• Lakukan pengujian kandungan virus untuk mengetahui kelompok mana yang menghasilkan titer virus paling tinggi
• Lakukan ulangan trial sebanyak minimal 3 kali ulangan untuk mengetahui validitas dari trial tersebut

Terima kasih semoga bermanfaat ………………….
Amiiin................